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一、实验条件:具有470nm波长的分光光度计、100℃水浴锅、40μl加样枪、定时器。

二、标本采集:按常规消毒方法消毒皮肤,肘静脉穿刺取血。采血之后,尽快分离出血清。

注意事项:

a、止血带压迫时间过长或过紧、抽血用的针头过小及全血在运输过程中受到振动都会引起溶血。

b、若当日不能检测,请将血清放在-10以下保存。低温保存的血清标本冻融后各种化学成份分布不均一,使用前须恢复室温融解并充分混匀反复冻融,会引起对冻融敏感的某些物质的变化,从而影响标本的稳定性。为了保证标本的质量,标本应避免反复冻融。

事例:某院检验科,负责千嬴国际实验操作的是一名研究生。在一次千嬴国际的体检中阳性率高达35%,公司的技术人员一到院方的实验室后就开始排查。发现他的操作十分严谨可以说是无可挑剔,那么是什么导致这次体检的假阳性升高呢?原来他忽略了标本的存放方式。虽然这批的体检量很大,但是做千嬴国际的限在45岁以上;所以每天只有几例,他一般累积到3050例才开始做。这一累积的时间少则2周,多则3周,而这期间所有软管内的血清标本合着下层的红细胞一直存放在45℃的冰箱内,由于存放的时间过长,血清的质量已发生了变化,且有的血清已溶血了。

三、实验步骤:

1、编号:在试剂管上编写相应的标本号。记号笔要能防水,避免水浴之后标识模糊。

2、加样:准确吸取40μl待测标本,加入试剂管中,盖紧盖子并扣上防爆扣,充分混匀后尽速进行加热显色。

注意事项:

a、加样量:40μl加样枪要经常校准;误差在±1μl以内。

b、加样时注意枪头是否有样液残留。每个样品使用一个吸头,以免造成污染;避免使用回收吸头。

事例:某医院所做的标准品吸光度值与理想值相差很远,但每次重做的吸光度值都很稳定。这说明他操作的重复性很好。在各个实验环节排差后,感到他枪的加样量有些可疑,他却十分自信说:“我这是进口的枪,用一百多美元购进的,你看,我转的正是40μl这一档”。他的实验室没有上皿天平,所以没法校枪,也没有另外一支可调到40μl的较精密的加样枪。只有一支注射器式的精度较差的微量加样器,还有就是样量0.5ml1.0ml的加样枪及公司技术员随身带的刚校准的40μl加样枪。在现有的条件下,做了一个实验,先用0.4ml加样枪在三只离心管中各加入0.4ml的水,分别用医院40μl进口枪、40μl注射器式的微量加样器,技术员40μl的加样枪各吸10次,结果,40μl注射器式的微量加样器及技术员40μl的加样枪吸第十次时,0.4ml的水已吸完了。而院方40μl进口枪吸十次后,离心管里仍剩约100μl的量。所以,不论进口,还是国产的枪,都必须经常校准,才能保证加样量的准确,从而保证实验的质量。接下来,进一步做实验,即同一人,用三种不同的加样枪,同做一组标准曲线,结果是显然的:注射器式的微量加样器,技术员所带的40μl的加样枪,吸光度值接近于理想的吸光度值,而院方40μl进口枪则普遍低于理想的吸光度值。

3、显色:加完样后,置100沸水浴中,反应15分钟,迅速取出置25以下的水中冷却5分钟以终止反应;反应液要在1小时之内检测。

注意事项:

a、加热和冷却的水位均要达到试剂管内反应液的高度,但不能过高,以免进水;冷却时,不能用自来水淋洗,以免进水。若检测样品过多,冷却水应及时更换或加冰袋,以确保反应完全终止。

b100保温反应15分钟,准确计时,误差在±30秒以内。

由于样品水浴反应的15分钟,需严格计时,所以,在15分钟到来之前,先准备好冷却水,并量好冷却水的水位,避免因临时备冷却水而延误反应时间。

c注意水浴锅的功率不能太低。不要用钢精锅、饭盒或电饭煲代替水浴锅。用配套的加热反应架,不要用泡沫板、木板或海绵块代替。

功率太低的水浴锅,当样品放入沸水中,温度骤降,样品量较大时水温降低至93~95℃,待其恢复到沸腾的状态要3-5分钟。而功率较大的水浴锅这一过程仅需30秒钟左右。

4、比色:将反应液置470nm波长处(以蒸馏水调零)读取标本的吸光度值。

注意事项:

a、分光光度计的型号很多,有721722722S753756等等,型号不同,仪器的特点也就不同。721型,0.5光程的比色杯比722S0.5光程的比色杯,要来得宽一些;同样1ml的反应液在721型的比色杯中,液位高度要来得低一些,在检测的过程中,721型的光束不能完全没在液面下,这时读出的吸光度值是不正常的。两台仪器所读的数据如下表。补救方法:在比色杯下垫上千嬴国际试剂管的盖子。

样号

722S

721

差值

1

0.415

0.460

0.045

2

0.402

0.460

0.058

3

0.374

0.430

0.056

4

0.488

0.520

0.032

A

 

 

 

B

 

 

 

 

 

b、分光光度计要注意定时年检。注意波长有否偏移,误差范围470±2nm,光路有否偏移。

事例:某医院使用的分光光度计,它的比色槽形状如图             ,把同一样品放在AB上测,结果不同,例:A0.485B0.390,这说明光路发生了偏移。

c、注意经常更换调零液(即蒸馏水),以保持蒸馏水的清洁。

事例:某院检验科,标准曲线做了好几次,平行性不错,但吸光度值全线偏低。公司技术人员到达实验室后,经过各环节的排查,发现,他的调零杯中的蒸馏水,由于太久未换,已长出了几朵像蒲公英一样的小菌落。这样的情况下,吸光度值怎么不全线偏低呢?

d、注意分光光度计的工作电压不要超出以下范围:220V±20V

事例:某院做千嬴国际时,标准品的吸光度值偏低,一直不能接近理想值,公司技术人员带了经检验合格的水浴锅,722S分光光度计到院方的实验室,和院方检验人员一起做实验,结果标准品的吸光度值也是较低。当时快下班,他们还是重做一次,结果却一切正常了。为什么呢。原来在重做的时候,实验室里的几台大型全自动仪器都关了。

四、标准曲线制作:

不同浓度的标准液(20U/ml40U/ml60U/ml80U/ml100U/ml、)各吸取40μl,分别加入试剂管中,其余操作同上。测定各个吸光度值,然后以千嬴国际单位值为横坐标,以吸光度值为纵坐标,作标准曲线。

注意事项:

标准品从冰箱中取出,恢复室温并充分摇匀后才能使用。

事例:某院检验科曾打电话到公司问,“你们的标准品很不稳定,每次测吸光度值都有差异……”。且告诉说,是同一套的标准品。公司问他“你的标准品从冰箱中取出,用前,有否混匀?”答:“噢,我忽略了”。事后,得知,经混匀后,几次测的值不再有差异,且都较接近理想值。

五、结果计算与判断:

1、根据标本吸光度值,求出相应的千嬴国际的含量。

2、含量<64u/ml判定为阴性,≥64u/ml而<71u/ml为可疑阳性,≥71u/ml为阳性。

六、试剂的保存方式:

 

试剂放在2-8℃保存是十分通常的方式,并无过高要求。其一是为了延长试剂稳定期,我们做了多次冷藏和常温试验,差异不大。2-8℃可保存半年,常温中也可三个月以上,所以常温运输没有问题;其二我们采用的是每份标本试剂预先定量分装,在2-8℃保存,可避免试剂蒸发,体积变化。

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